Abschlussbericht zum Promotionsstipendium

für Frau M. Pali

Bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) kommt es zu einer unkontrollierten Vermehrung von Vorläuferzellen, die für die Bildung der weißen Blutkörperchen (Leukozyten) zuständig sind. Obwohl die konventionelle Chemotherapie in ca. 70% der Patienten zu einer Remission führt, treten in etwa 80% der Fälle bereits innerhalb von 2 Jahren Rückf.lle auf, woran die meisten Patienten versterben.

 

Es ist derzeit gängige Lehrmeinung, dass die verbleibenden Blasten sich der Zytostatika-

Behandlung und Bestrahlung durch das Einnisten in die Knochenmark-Bindegewebs-(Stroma) Nische entziehen. Die nach der Chemotherapie persistierenden Leukämiezellen führen in einiger Zeit zu einem erneuten Krankheitsausbruch.

 

Ziel des Projektes war die Identifizierung neuer Signalwege, die die Interaktion der resistenten Blasten mit den Bindegewebsknochenmarkzellen aufdecken. Wenn die Abwehrstrategie der  nach Chemotherapie überlebenden Leukämiezellen (sogenannte Leukämiestammzellen) verstanden wird, kann man auf eine medikamentöse Beeinflussung dieser Zellen hoffen, um diese Zellen abzutöten und Leukämie dauerhaft heilbar zu machen.

 

Meine Arbeit erfolgte im Rahmen eines von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderten Projektes, welches sich mit dem Überleben von Restleukämiezellen beschäftigt. Die Situation in Menschen stellen wir in einem Modell nach, in dem Leukämie Zellen direkt an gesunden Bindegewebszellen (mesenchymal stem cells – MSC) anheften und mit ihnen interagieren.

 

Dazu habe ich ein in vitro System entwickelt, bei dem in Leukämie Zellen ein Licht erzeugendes Gen eingepflanzt wurde (Gaussia-Luciferase-Gen genannt) und wo durch die Messung der Lichtaktivität das Wachstum von Leukämiezellen quantifiziert wird.

Abb. 1 Die mit Gaussia

luciferase lentiviral

transfizierten HL60

Zellen wurden in einer

wachsenden

Verdünnungsreihe

angesetzt und nach 48h

Kultur am Luminometer

nach Zugabe vom

Coelenterazine Substrat

vermessen. Die

Lichtaktivität steigt direkt

proportional mit der HL60

Zellzahl und gibt somit

Auskunft über die

Proliferation der

Leukämiezellen.

Basierend auf diesem Modellsystem konnte ich zeigen, dass die Bindegewebszellen einen entscheidenden Einfluss sowohl auf das Wachstum, als auch auf das Überleben der Leukämie Zellen nach Zytostatika Behandlung haben.

Abb. 2 Links ist

dargestellt, dass -

gemessen durch

Lichtmenge - die

Leukämiezellen am

stärksten wachsen, wenn

sie in direktem Kontakt

zu den

Bindegewebszellen

(MSC) stehen. Dieses

führt dazu, dass die

Leukämiezellen (grau ist

die Fraktion in Ko-Kultur)

unter Chemotherapie

(Ara-C) überleben

(rechte Darstellung).

Abb. 3. Es wurde die

Transfektion der mesenchymalen Stammzellen mittels Lipofektion etabliert und

anschließend gezielt 3 Gene ausgeschaltet: PTEN ist bekanntlich ein Tumorsuppressor, der bei Ausschaltung von Stroma zur

unkontrollierten Krebszellen Vermehrung führt, Ets-2 ist sein

Antagonist. VCAM-1 ist ein für das Anhaften der

Leukämiezellen an das

Bindegewebe und Gefäße zuständiges Gen.

Es erfolgten desweiteren die Messungen des Wachstums der Leukämie Zellen auf die transfizierten Bindegewebszellen nach oben dargestellter Methode. Das Wachstum der Leukämiezellen war nicht sehr beeinflußt. Abschließend erfolgt jetzt eine Chemotherapie- Behandlung der auf dem genetisch veränderten Bindegewebe lebenden Leukämiezellen, um deren Resistenz zu verstehen. Hierzu erfolgt die Vitalitätsbestimmung der Leukämiezellen mit Hilfe einer Anfärbung auf Annexin (früher Zelltod) und DAPI (später Zelltod). Dies ist in Abbildung 5 dargestellt. Die nach Zytostaktika Behandlung überlebenden Zellen geben Auskunft über diejenigen Gene, die zum Überleben der leukämischen trotz Behandlung führen.

Abb. 4 Ohne Behandlung

sind alle Zellen lebendig

und färben sich weder

mit Annexin (y-Achse,

frühe tote Zellen) noch

mit DAPI (x-Achse,

Zellen in späterer

Absterbephase) an. Auf

Behandlung mit

Zytostatika sterben die

Zellen dann in

unterschiedlichem Maße

(resisten? sensibel?) ab.

In der rechten Abbildung

sind unter

Chemotherapie (wieder

Ara-C) einige Zellen in

den Zelltod eingetreten

und zeigen Anfärbung

durch Fluoreszenz auf

beiden Achsen (Annexin

und DAPI).

Da bei Vorarbeiten der AG Brendel ein Gen gefunden wurde, welches auch in Bindegewebszellen im Ko-Kultur-Modell heraufreguliert ist, habe ich ergänzend versucht, dieses Molekül - die Haemoxygenase-1 - durch einen spezifischen Hemmstoff - ZinkProtoporphyrin (ZnPP) auszuschalten. Hier konnte ich zeigen, dass die Leukämiezellen, die in direktem Kontakt zu den Bindegewebszellen stehen, besonders sensibel auf das ZnPP reagieren.

Abb. 5 Hier wird gezeigt,

dass gerade die

Leukämiezellen mit

direktem Kontakt zu

Bindegewebe

(contact=dunkelgrau))

sehr empfindlich auf

steigende

Konzentrationen von

ZnPP reagieren und

absterben.

Zusammenfassung der Ergebnisse:

 

  1. Ein Ko-Kultursystem wurde etabliert, welches zeigt, dass Leukämiezellen durch Interaktion mit "Bindegewebszellnischen" besser wachsen und einen Überlebensvorteil erlangen.
  2. Verschiedene Gene wurden in den Bindegewebszellen ausgeschaltet, welche das Wachstum und die Resistenz der ko-kultivierten Leukämiezellen beeinflussen.
  3. Mit Zink-Protophorphyrin (ZnPP) wurde eine körpereigene Substanz gefunden, die insbesondere die Leukämiezellen abtötet, die durch Kontakt zu Bindegewebe vom Zelltod durch konventionelle Chemotherapeutika verschont bleiben.

 

Geplant ist, diese Erkenntnis im Rahmen der Klinischen Forschergruppe KFO210 nun weiterzuverfolgen, die Mechanismen dieser Wirkung genau aufzuklären und in Tierversuchen der Frage nachzugehen, ob es gelingt, humanisierte Mäuse, die nach Injektionen von Leukämiezellen eine menschliche Leukämie entwickeln, durch eine kombinierte Therapie von herkömmlichen AML-wirksamen Chemotherapeutika und zusätzlich ZnPP besser zu "heilen".

 

Ich möchte mich bedanken bei der Carsten Bender Leukämie-Stiftung, durch deren Unterstützung ich ein klinisch wichtiges Promotionsthema bearbeiten und sehr viel theoretisches und praktisches Wissen in der Grundlagenforschung erwerben konnte.

 

Ein Teil meiner bisherigen Arbeiten wurde bereits zusammen mit Arbeitskollegen aus der Forschungsgruppe Dr. Brendel auf dem Internationalen Symposium „Acute Leukemias XIV – Biology and Treatment Strategies“ in Februar dieses Jahres als Poster in München vorgestellt. (s. Anlage)

 

Marburg, den 26.04.2013

 

Mihaela Pali

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