Zwischenbericht für das Projekt "Identifizierung von neuen Interaktionsnetzwerken innerhalb der hämatopoietischen Nische bei der akuten myeloischen Leukämie" der Arbeitsgruppe Angiogenese vom Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

Zwischenbericht für das Projekt

 

„Identifizierung von neuen Interaktionsnetzwerken innerhalb der hämatopoietischen Nische bei der

akuten myeloischen Leukämie“der Arbeitsgruppe Angiogenese vom Universitätsklinikum Hamburg-

Eppendorf.

 

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne Erkrankung des blutbildenden Systems mit

äußerst schlechter Prognose für die Patienten. Leukämie-Stammzellen (leukemic stem cells, LSC) sind

in den Fokus der zielgerichteten Therapiestrategien gerückt, da sie aufgrund ihrer Chemotherapie-

Resistenz für die schlechte Prognose der AML verantwortlich gemacht werden (Dick et al, Blood 2008,

112(13)). Im Knochenmark stehen die LSCs innerhalb der so genannten Leukämie-Stammzell-Nische

in enger Interaktion mit einer Reihe von Stromazellen (Konopleva et al, JCO 2011, 29(5):591-9). Das

Ziel unserer Arbeit war, neue nteraktionsnetzwerke zu identifizieren, die für das Zusammenspiel von

Leukämie- und ihren Stromazellen von Bedeutung sind und somit Zielstrukturen für neue

Therapiekonzepte darstellen könnten. Hierzu wurden Co-Kulturen aus primären AML-Zellen mit

Stromazellen durchgeführt. Zum Vergleich wurden zudem Co-Kulturen mit hämatopoietischen

Vorläuferzellen gesunder Spender angesetzt, die das gesunde Pendant einer entarteten Leukämiezelle

darstellen. Zunächst wurden die mononukleären Zellen aus frischen Knochenmarksbiopsien von AML-Patienten mittels Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Parallel hierzu wurden CD34 positive hämatopoietische Vorläuferzellen mittels immunmagnetischer Separation aus dem Blut von gesunden Spendern isoliert. Anschließend wurden die Leukämie- und gesunden Progenitorzellen auf primäre Endothelzellen oder Osteoblasten gegeben. Neben den Co-Kulturen wurden alle Zelltypen auch in Einzelkulturen kultiviert. In Abbildung 1 ist der Versuchsaufbau schematisch zusammengefasst. Nach einer Inkubationszeit von einigen Stunden wurden die Co-Kulturen vorsichtig wieder voneinander getrennt. Aus den einzelnen Zellfraktionen wurde die mRNA isoliert und für die Genexpressionsanalysen im Microarray vorbereitet.

 

 

Abbildung 1.

Abbildung 1.

Co-Kultur-Ansätze. In den Co-Kulturen wurden AML-Zellen (AML, grün) und CD34+-

Progenitorzellen (HSC=hematopoietic stem cell,

gelb) jeweils mit primären Endothelzellen (EC = Endothelial cell, blau; links) sowie primären Osteoblasten (Ob = Osteoblast, pink; rechts) co-kultiviert.

Neben den Co-Kulturen wurden alle Zelltypen auch als Einzelkulturen angesetzt.

Insgesamt wurden Co-Kulturen aus drei primären AML-Proben sowie CD34 positiven Vorläuferzellen

gesunder Spender im Microarray (Affymetrix GeneChip Human Gene 2.0 ST Array) analysiert. Eine

erste Voranalyse zeigte, dass der Microarray geeignet war, Leukämie- von gesunden

hematopoietischen Vorläuferzellen abzugrenzen, da diese sich in getrennten Gen-Clustern darstellen

ließen.

Die weitere Analyse zeigte, dass eine große Anzahl von Genen eine veränderte Expression zwischen

Leukämie und gesunden hämatopoietischen Vorläuferzellen aufwies, was sowohl für die Einzel- als

auch Co-Kulturen mit Endothelzellen und Osteoblasten zutraf.

 

Im nächsten Schritt wurden die Gene herausgefiltert, die sich zwischen Leukämie- und gesunden

hämatopoietischen Zellen unterschieden, jedoch nicht durch die Co-Kultur induziert wurden. Nach

diesem Auschluss blieben 114 Gene in der Analyse, deren veränderte Expression entweder durch den

Kontakt mit Endothelzellen oder Osteoblasten ausgelöst worden war.

Als nächstes wurde eine intensive Literaturrecherche betrieben, um Kandidaten auszuwählen, die

potentiell interessant für weitere Analysen sein könnten. Zunächst wurden ca. 30 Gene ausgewählt, für

die bereits ein Zusammenhang mit verschiedenen Krebsentitäten, eine Rolle in der Endothelzell- oder

Osteoblasten-Biologie oder eine Funktion in der allgemeinen Zellproliferation oder –differenzierung

bekannt war.

 

Die ausgewählten Gene sollten auf ihre prognostische Relevanz untersucht werden. Hierzu wurden

publizierte Genexpressionsdaten von 290 AML-Patienten verwendet, zu denen uns klinische Daten vorlagen (Gen Expression Omnibus Datenbank GSE6891; Verhaak et al, Haematologica 2009). Die statistische

Analyse ergab, dass eine Reihe der Gene tatsächlich prognostische Marker für AML-Patienten darstellten, da die Kaplan-MeierÜberlebenskurven signifikante oder borderline-signifikante Unterschiede aufzeigten. Eines dieser Gene ist PLS3, was für das Protein Plastin-3 codiert.

 

Plastin-3 gehört zu den Aktin-Bindeproteinen und spielt somit vermutlich eine Rolle im Umbau des

Zytoskeletts und der Motilität von Zellen. Eine wichtige Rolle scheint Plastin-3 in der Knochen- und

somit Osteoblasten- Biologie zu spielen, da Defekte im Gen mit Osteoporose und Knochenfrakturen in

Verbindung stehen (van Dijket al, NEJM 2013). Darüber hinaus konnte das Gen Plastin-3 bereits mit

mehreren Krebsentitäten in Zusammenhang gebracht werden. Eine erhöhte Expression von PLS3 stellt

einen wichtigen Biomarker beim Sézary-Syndrom dar, einer Form des kutanen T-Zell-Lymphoms

(Nebozhyn et al, Blood 2006; Michel et al, Blood 2013). Kürzlich konnte zudem gezeigt werden, dass

Plastin-3 auch beim Colon-Karzinom von Bedeutung ist, wo es mit einer hohen Invasivität der Zellen

sowie einer schlechten Prognose assoziiert ist (Yokobori et al, Cancer Research 2013; Sugimachi, Ann

Surg Oncol 2013). Ausgehend von dieser Datenlage möchten wir in der Fortführung des Projektes

daher zunächst die Rolle von Plastin-3 in der akuten myeloischen Leukämie näher untersuchen.

Im Anschluss sollen Untersuchungen zu einer Reihe weiterer Gene, welche wir identifizieren konnten, folgen.

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